RNA-seqデータ前処理：品質評価からゲノムマッピングまで【BI入門⑦】

こんにちは、バイオインフォマティクス実践ラボ管理者のnomura-yです。

RNA-seq解析の成功は、適切なデータ前処理にかかっていると言っても過言ではありません。生データには、シーケンスの過程で生じる低品質なリードやアダプター配列など、ノイズとなる要素が多数含まれています。これらのノイズを適切に除去し、高品質なデータに整えることが、その後の解析結果の信頼性を大きく左右します。

今回は、RNA-seqデータ解析における前処理であるクオリティコントロール手法を解説します。さらに、ゲノム参照配列へのマッピング手順と、解析に適したデータとするための成功のポイントを解説します。

【BI入門①】R入門：環境構築と基本操作
 【BI入門②】R実践：データの可視化と関数活用
 【BI入門③】Rによる生物データハンドリング
 【BI入門④】Python入門：Windows上でのPython・Jupyter実行環境構築
 【BI入門⑤】PythonとPandas：表形式データの強力な操作術
 【BI入門⑥】RNA-seq解析の基礎：有効なケース、全体の流れと主要ツール
 【BI入門⑦】RNA-seqデータ前処理：品質評価からゲノムマッピングまで　←本記事
【BI入門⑧】RNA-seqデータ解析：発現定量と主要なデータ可視化手法

RNA-seqにおけるデータ前処理のステップ

RNA-seq解析の一般的な流れの中で、今回は特に以下のステップに注目します。

クオリティチェック:FastQCを用いてリード配列の品質を確認します。
- シーケンスリードの品質とは、塩基（A,T,G,C）がどれだけ正確に読み取られたかという信頼度を指します。この信頼度は品質スコア（Phred score)で数値化され、一般的にスコア30（エラー率0.1%）が品質の目安とされます。特にリードの終盤（3'末端）では、シーケンス反応がサイクルを重ねるにつれて試薬の劣化などが起こり、信号の精度が徐々に低下するため品質が下がる傾向があります。FastQCのレポートを確認することで、リードの長さ分布、塩基ごとの品質スコア、GC含量などを視覚的に把握できます。

クオリティコントロール:PRINSEQなどのソフトウェアを用いて、PolyA/Tテイルの除去、品質の低いリード末端のトリミング、配列長が短いリードの除去を行います。
- 配列リードの全長にわたりスコアが30以上となるように調整し、解析の信頼性を高めます。PolyA/TテイルはmRNAの構造に由来するもので、マッピングの妨げになるため除去が必要です。また、品質スコアの低い末端部分はエラーが多く含まれる可能性が高いため、トリミングすることで正確なマッピングを促進します。短いリードも非特異的なマッピングの原因となるため除去します。

マッピング:STARなどのソフトウェアを用いて、クリーニング済みのリードをゲノム参照配列（例：ヒト参照配列hg38）にマッピングします。
- マッピング率、ユニークにマップされたリードの割合などをチェックすることで、解析に適したデータかを判断します。高いマッピング率は、シーケンスデータが参照ゲノムとよく一致していることを示し、信頼性の高い発現定量につながります。高性能な計算サーバで並列処理を行う場合、（データ量にも大きく依存しますが）各サンプルをマッピングするのに1～1.5時間程度かかります。これは、データ量が非常に大きいため、高性能な計算資源が不可欠であることを示しています。